總RNA提取試劑盒

總RNA提取試劑盒 核酸提取

產(chǎn)品貨號(hào)：NAET01

產(chǎn)品名稱(chēng)：總RNA提取試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：100ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

Total RNA Extraction Reagent (Trizol) 是一種包含酚/異硫氰suan胍等物質(zhì)的總RNA提qu試劑，該試劑可迅速裂解組織和細(xì)胞樣本釋放出核酸，有效抑制核酸酶活性從而保證RNA的完整性。本產(chǎn)品適用于從人、動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌等各種組織或細(xì)胞中快速分離總RNA，在保證RNA純度高、完整性好的同時(shí)最da限度的去除了蛋白質(zhì)和基因組DNA等雜質(zhì)，提取流程可在1 h內(nèi)完成，產(chǎn)物可直接用于RT-PCR、NorthernBlot、體外翻譯等實(shí)驗(yàn)。

產(chǎn)品特點(diǎn)

適用范圍廣；

操作簡(jiǎn)單快速，整個(gè)過(guò)程可在1 h內(nèi)完成；

純度高、污染少。

注意事項(xiàng)

Total RNA Extraction Reagent (Trizol) 是強(qiáng)腐蝕性物質(zhì)，操作過(guò)程中應(yīng)穿上實(shí)驗(yàn)服，戴好乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，防止吸入口鼻。沾染皮膚或眼睛后，請(qǐng)立即用清水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)生的幫助。

使用方法

試劑準(zhǔn)備

1. 自備試劑：無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇等。

2. 去酶處理：RNase是導(dǎo)致RNA降解最主要的物質(zhì)，必須使用RNase-free的實(shí)驗(yàn)器具，包括槍頭和離心管，并且RNA實(shí)驗(yàn)用的器具需專(zhuān)門(mén)使用，避免交叉污染。

3. 樣品保存：勻漿后，加氯仿前，樣品可在-80°C放置一個(gè)月以上；提取的RNA樣品可以在70% 酒精中-20°C保存2個(gè)星期以上；如需長(zhǎng)期保存，請(qǐng)置超低溫冰箱中保存。

樣本準(zhǔn)備

1. 動(dòng)物/植物組織

取新鮮組織樣品在液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至研缽中迅速充分研磨，期間可補(bǔ)充液氮并研磨直至樣本呈粉末狀，隨后以50~100 mg樣本使用1 mL Total RNA Extraction Reagent比例勻漿處理

*樣品體積一般不要超過(guò)Total RNA Extraction Reagent體積的10%。

2. 貼壁細(xì)胞

2.1 直接裂解法：倒出培養(yǎng)液，用1×PBS清洗1次后在培養(yǎng)板中加入Total RNA Extraction Reagent直接裂解細(xì)胞，或直接在培養(yǎng)板中加入Total RNA Extraction Reagent裂解細(xì)胞，每10 cm2培養(yǎng)面積生長(zhǎng)的細(xì)胞加1 mL Total RNA Extraction Reagent。用移液器反復(fù)吹打混勻直至無(wú)明顯沉淀。

*培養(yǎng)面積不超過(guò)10 cm2，細(xì)胞不超過(guò)1×107。

2.2 胰蛋白bai酶處理法：收集細(xì)胞并大致確定細(xì)胞數(shù)量，用PBS洗滌后，向細(xì)胞中加入含有0.1-0.25% 胰蛋bai酶的PBS處理細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞脫離容器壁后，加入含有血清的培養(yǎng)基失活胰蛋bai酶，將細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移至無(wú)RNase的離心管中，8,000 rpm離心5 min，收集細(xì)胞沉淀并去除上清。每10 cm2面積加1 mL Total RNA Extraction Reagent。用移液器吹打混勻。

3. 細(xì)胞懸液

離心收集細(xì)胞。每5×106-107動(dòng)物、植物和酵母細(xì)胞或每107細(xì)菌細(xì)胞加入1 mL Total RNA Extraction Reagent。

*加入Total RNA Extraction Reagent前不要洗滌細(xì)胞，以免降解mRNA。

*對(duì)于難以裂解的酵母和革蘭氏陽(yáng)性菌需要液氮研磨或勻漿器勻漿。

4. 血液

取0.5 mL新鮮或凍溶的血液，12,000 rpm離心5 min，去除血漿后加入1 mL Total RNA Extraction Reagent，充分振蕩混勻。

RNA抽提步驟

1. 將上述裂解液或勻漿液室溫靜置5-10 min使蛋白和核酸充分分離；

2. 向上述裂解液或勻漿液中加入1/5 Total RNA Extraction Reagent體積的氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，溶液呈乳濁狀，室溫靜置5 min；

* 徹di混合有利于后續(xù)的相分離。

3. 12,000 rpm 4℃離心10~15 min。此時(shí)樣品分為3層，即上層無(wú)色的水相（含RNA）、中間層和下層有機(jī)相。

4. 小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇上下顛倒充分混勻，室溫放置10~20 min；

* 水相體積約占Total RNA Extraction Reagent體積的60%，建議吸取400 μL左右，避免吸取到中間層導(dǎo)致基因組DNA的污染。

5. 12,000 rpm 4℃離心10 min，去上清，此時(shí)管底會(huì)出現(xiàn)白色膠狀沉淀；

6.使用1 mL 75% 乙醇 (用RNase-free水配制) 洗滌沉淀。12,000 rpm 4℃離心5min，棄去上清；

7. 重復(fù)步驟6；

8. 室溫晾干5~10 min。加入30~50 μL的RNase-free水溶解沉淀，必要時(shí)可用移液器輕輕吹打或在55~60℃孵育5~10 min。待沉淀完quan溶解后將所得到的RNA溶液置于-80°C保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。

RNA的分析和定量

1. 測(cè)定樣品在260 nm和280 nm的吸收值確定RNA純度，按1 OD=40 µg RNA計(jì)算RNA的產(chǎn)率。

* OD260/280 在1.8-2.0視為抽提RNA的純度很高。

2. 進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖電泳，確定RNA的完整性和污染情況。

常見(jiàn)問(wèn)題分析

1. 提取的RNA量較少

1) 取樣量少。

2) 樣品裂解或勻漿處理不徹di，RNA沒(méi)有被完quan釋放。

3) 得到的RNA沉淀未完quan溶解。

2. RNA樣品的260/ 280比值小于1.6

1) 樣本勻漿或裂解時(shí)Total RNA Extraction Reagent較少或加入試劑后未室溫放置5 min導(dǎo)致RNA與蛋白質(zhì)、DNA未充分分離。

2) 水相中混有有機(jī)相，從而有蛋白質(zhì)和DNA污染。

3) RNA未用水溶解，在TE這種低離子濃度和低pH條件下，A280值會(huì)偏高。

4) 抽提得到的RNA沉淀未完quan溶解。

3. 提取RNA樣品發(fā)生部分或完quan降解

1) 所用組織或細(xì)胞保存不當(dāng)，樣品沒(méi)有及時(shí)用液氮凍存，導(dǎo)致組織或細(xì)胞中的RNA降解。

2) 細(xì)胞在胰蛋bai酶時(shí)消化過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致加Total RNA Extraction Reagent前RNA已經(jīng)部分降解。

3) 溶液或離心管等耗材未經(jīng)RNase處理，RNase的污染導(dǎo)致RNA被降解。

4. RNA樣品中存在DNA污染

1) 樣品勻漿時(shí)加的試劑體積太少。

2) 樣品中含組織溶劑（如乙醇等）或堿性溶液，致水相減少或pH升高。

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