單胺氧化酶（Monoamine Oxidase，MAO）試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

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正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

MAO(EC1.4.3.4) 主要存在于脊椎動(dòng)物的各種器官，特別是分泌腺、腦、肝臟，在無(wú)脊椎動(dòng)物、豆類(lèi)的芽等植物中也存在催化單胺類(lèi)物質(zhì)代謝，含量較低，具有重要的生理功能，其活性能反映肝纖維化的程度。此外，MAO 活性異常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)轉(zhuǎn)出現(xiàn)紊亂，從而引發(fā)多種病癥。

測(cè)定原理：

MAO 催化單胺類(lèi)底物脫氨生成相應(yīng)的醛，進(jìn)一步氧化成酸；底物在 360nm 處有特征吸收峰，測(cè)定360nm 光吸收下降的速率，計(jì)算MAO 活性。

試劑組成和配制：

需自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、稱(chēng)取約 0.1g 樣品，加 1 ml 預(yù)冷的提取液一充分冰浴勻漿，1000g，4℃，離心 10min，棄沉淀；把上清轉(zhuǎn)移到另一預(yù)冷的離心管，10000g，4℃，離心 30min，棄上清；加入 1ml 預(yù)冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心 40min，棄上清；沉淀加入預(yù)冷的 1ml 試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測(cè)定）。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g， 4℃，離心 10min，棄沉淀；把上清轉(zhuǎn)移到另一預(yù)冷的離心管，10000g，4℃，離心 30min，棄上清；加入1.0 ml 預(yù)冷的提取液二，震蕩混勻，16000g，4℃，離心 40min，棄上清；沉淀加入預(yù)冷的 1.0 ml 試劑一，震蕩混勻，即粗酶液（可用于可溶性蛋白濃度測(cè)定），取上清置于冰上待測(cè)。

3、血清：直接測(cè)定。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 360nm，蒸餾水調(diào)零。

2、操作表：

混勻，于微量石英比色皿/96 孔板，對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定 360nm 處吸光值A(chǔ)1，然后 37℃水浴 60min，對(duì)照管調(diào)零，測(cè)定 360nm 處吸光值A(chǔ)2。ΔA=A1-A2 注意：空白管只需測(cè)定一次。

MAO 活性計(jì)算公式：

a．用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、按蛋白含量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6 時(shí)，每毫克蛋白質(zhì) 1min 內(nèi)轉(zhuǎn)化 1 nmol 底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

?A

DAO 活性（nmol/min / mg prot）= 2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

?? d ×V 反總÷（V 樣× Cpr）÷T= 114×ΔA÷Cpr

酶活定義：37℃，pH7.6 時(shí)，每克樣品 1min 內(nèi)轉(zhuǎn)化 1 nmol 底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

?A

DAO 活性（nmol/min / g 鮮重）=?? d ×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T = 114×ΔA÷ W 3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6 時(shí)，每 104 個(gè)細(xì)胞 1min 內(nèi)轉(zhuǎn)化 1 nmol 底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

?A

DAO 活性（nmol/min / 104 cell）=

= 114×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量 4、按照液體體積計(jì)算 

?? d ×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T

酶活定義：37℃，pH7.6 時(shí)，每升血清 1min 內(nèi)轉(zhuǎn)化 1 nmol 底物的酶量為一個(gè)酶活單位

ε：底物摩爾消光系數(shù)，1460L /mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)總體積，0.2ml；V 樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；T：反應(yīng)時(shí)間， 60min，W：樣本質(zhì)量，g

a．用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1、按蛋白含量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6 時(shí)，每毫克蛋白質(zhì) 1min 內(nèi)轉(zhuǎn)化 1 nmol 底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

?A

DAO 活性（nmol/min / mg prot）= 2、按樣本質(zhì)量計(jì)算：

?? d ×V 反總÷（V 樣× Cpr）÷T= 228×ΔA÷Cpr

酶活定義：37℃，pH7.6 時(shí)，每克樣品 1min 內(nèi)轉(zhuǎn)化 1nmol 底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

?A

DAO 活性（nmol/min / g 鮮重）= ?? d ×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T = 228×ΔA÷ W 3、按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：37℃，pH7.6 時(shí)，每 104 個(gè)細(xì)胞 1min 內(nèi)轉(zhuǎn)化 1nmol 底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

?A

DAO 活性（nmol/min / 104 cell）=

= 228×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量

4、 按照液體體積計(jì)算

?? d ×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T

酶活定義：37℃，pH7.6 時(shí)，每升血清 1min 內(nèi)轉(zhuǎn)化 1nmol 底物的酶量為一個(gè)酶活單位。

?A

DAO 活性（nmol/min /L）=?? d ×V 反總÷V 樣=228000×ΔA

ε：底物摩爾消光系數(shù)，1460L /mol /cm； d：96 孔板光徑，0.5cm；V 反總：反應(yīng)總體積，0.2ml；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；T：反應(yīng)時(shí)間，60min，W：樣本質(zhì)量，g

注意事項(xiàng)：

吸光度變化應(yīng)該控制在 0.01～0.8 之間。否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計(jì)算公式中參與計(jì)算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。

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