脂肪酸合成酶（FAS）活性試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

脂肪酸合成酶FAS活性試劑盒

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

FAS 是脂肪酸合成關(guān)鍵酶，催化乙酰輔meiA 和丙二酰輔meiA 而生成長(zhǎng)鏈脂肪酸。FAS 普遍表達(dá)于各種組織細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達(dá)豐富。

測(cè)定原理：

FAS 催化乙酰CoA、丙二酰 CoA 和NADPH 生成長(zhǎng)鏈脂肪酸和NADP⁺；NADPH 在 340nm 有吸收峰，而NADP⁺沒(méi)有；通過(guò)測(cè)定 340nm 光吸收下降速率，計(jì)算 FAS 活性。

組成：

試劑一：液體 100ml×1 瓶，－20℃保存。用前 1d 取出置于 4℃充分解凍后混勻。

試劑二：粉劑×1 瓶。臨用前加入 440μl 試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 440μl 試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 840μl 試劑四，充分溶解，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

粗酶液提取：

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 40min，取上清置冰上待測(cè)。

細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 12000g， 4℃，離心 40min，取上清置于冰上待測(cè)。

血清等液體：直接測(cè)定。

FAS 測(cè)定操作：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

試劑四置于 40℃水浴中預(yù)熱 30 min。

在 96 孔板或 EP 管中依次加入 20μl 上清液、4μl 試劑二、4μl 試劑三、164μl 試劑四和 8μl 試劑五，混勻后于 340nm 處測(cè)定吸光值，記錄第 30s 和 90s 時(shí)吸光值，分別記錄為A1 和A2?！鰽 測(cè)=A1-A2。

FAS 活性計(jì)算：

使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反總×109) ÷(Cpr×V 樣)÷T

=1608×△A÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V 反總×109) ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×△A ÷W

按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V 反總×109) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

按液體體積計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol /min/ml) =(△A÷ε÷d×V 反總×109) ÷V 樣÷T

=1608×△A

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，200μl=2×10-4L； Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μl=0.02 ml；V樣總：提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反總×109)÷(Cpr×V 樣)÷T

=3216×△A÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V 反總×109) ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=3216×△A÷W

按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V 反總×109)÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=3216×△A÷細(xì)胞數(shù)量

按液體體積計(jì)算

活性單位定義：37℃中每毫升樣本每分鐘氧化 1nmol NADPH 為 1 個(gè)酶活單位。

FAS(nmol /min/ml) =(△A÷ε÷d×V 反總×109 )÷V 樣÷T

=3216×△A

ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，

200μl=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μl=0.02 ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

脂肪酸合成酶FAS活性試劑盒