糖原磷酸化酶b（Glycogen phosphorylase b，GPb）試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

糖原磷酸化酶b試劑盒

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代謝的關(guān)鍵酶，使糖原分子從非還原端逐個(gè)斷開α-1，4-糖苷鍵移去葡萄糖基，釋放 1-磷酸葡萄糖，直至臨近糖原分子α-1，6-糖苷鍵分支點(diǎn)前 4 個(gè)葡萄糖基處。GP 分為有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa）和無活性的糖原磷酸化酶 b（GPb）兩種形式。GPb 在一定濃度的腺苷酸（5，-AMP）存在下可被激活。

測(cè)定原理：

GP 催化糖原和無機(jī)磷產(chǎn)生葡萄糖殘基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADP 還原生成NADPH，在 340nm 下測(cè)定NADPH 上升速率，即可反映 GP 活性。添加一定濃度的腺苷酸（5，-AMP）時(shí)測(cè)定GP（GPa 和GPb）活性，未添加腺苷酸（5，-AMP）時(shí)測(cè)定GPa活性，GP 活性－GPa 活性得到GPb 活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零；

2、工作液的配制：臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、試劑三的配制：臨用前在試劑三瓶中加入 1ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

4、試劑四的配制：臨用前在試劑四瓶中加入 1ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

5、試劑五的配制：臨用前在試劑五管中加入 500μl 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

6、將工作液、試劑三、試劑四和試劑五置于 37℃預(yù)熱 5 分鐘；

7、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、10μl 試劑三、10μl 試劑四、10μl 蒸餾水和 160μl 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處 5min 后的A1 和 10min 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔAGPa=A2-A1。

8、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、10μl 試劑三、10μl 試劑四、10μl 試劑五和 160μl 工作液，立即混勻，記錄 340nm 處 5min 后的A3 和 10min 后的吸光值A(chǔ)4，計(jì)算ΔAGP=A4-A3。

注意：由于每個(gè)樣本需要同時(shí)測(cè)一個(gè) GP（GPa 和GPb）活性和一個(gè)GPa 活性，因此本試劑盒 100 管測(cè) 48個(gè)樣本。

GPb 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP－ ΔAGPa)÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GPb（nmol/min/g 鮮重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑， 1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1286×(ΔAGP－ ΔAGPa)÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算

單位定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生 1nmol NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。

GPb（nmol/min/g 鮮重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總)÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑， 0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。

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