異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL）試劑盒說(shuō)明書

微量法 100 管/96 樣

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正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

ICL（EC4.1.3.1）主要存在于植物和微生物中，油料作物種子在萌發(fā)過(guò)程中，通過(guò)乙醛酸循環(huán)及其他過(guò)程將脂肪轉(zhuǎn)變成碳水化合物。ICL 是乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一。

測(cè)定原理：

ICL 催化異檸檬酸降解為乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和 NADH 在LDH 的作用下生成乙醇和NAD，NADH在 340nm 下有特征吸收峰，監(jiān)測(cè) 340nm 吸光度的減小速率可間接反應(yīng)ICL 活性。

試劑組成和配制：

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

樣本的前處理：

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：

先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：

按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定

工作液的配置，將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移至試劑一中，充分混合溶解，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

在試劑四中加入 4ml 蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、150μl 工作液和 40μl 試劑四，混勻，立即記錄340nm 處 20s 時(shí)的吸光值A(chǔ)1 和 2min20s 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

ICL 活性計(jì)算：

用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白中每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=1608×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=3.215×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白中每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=3216×ΔA÷W

按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

ICL（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=6.25×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

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